JRD Vol. 48, No. 5 (2002)

牛体外成熟・受精・発生胚の性とG6PD活性の関係及び異なる気相条件下におけるG6PD活性の胚発生に及ぼす影響（J. Reprod. Dev. 48: 447-453, 2002）

岩田尚孝1)・木村康二2)・橋本　周3)・太田麻由子1)・富永敬一郎4)・南直治郎5)

1)神戸みのりの公社
2)農林水産省草地試研場
3)雪印ET研究所
4)兵庫県中央農業技術センター
5)京都大学大学院農学研究科

　哺乳動物の雌初期胚ではX染色体上にある遺伝子の不活化が起こることが知らており、これ以前ではそれらの遺伝子がコ－ドする酵素活性が性間で異なっている時期があると思われる。本実験では、性間で予想される酵素活性差が、特定の培養条件において胚が受ける影響を左右するかどうかについて検討した。グルコース6燐酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）はX染色体上にある遺伝子にコードされている酵素でありその活性をBrilliant Cresyl Blue（BCB）によって間接的に推定することが出来る。実験1では発生各ステージの胚を用いてそれらの性とBCB染色によって推定される酵素活性の関係について検討した。その結果8、16細胞期胚及び胚盤胞期胚では両者の間に関係は認められなかったが、桑実期胚においてはBCB染色によって酵素活性が高いと判定された胚に雌が多く（81%）低いと判定された胚に雄が多い（35%）ことが示された。また実験2ではBCB染色を用い桑実胚をG6PD活性の高低で分類し、それぞれを高酸素もしくは低酸素の気相条件下で培養した。低酸素条件下では酵素活性が高いと判定された胚群と低いと判定された胚群の胚盤胞期への発生率の間には差は認められなかったが、高酸素条件下では酵素活性が高いと判定された胚群は酵素活性が低いと判定された胚群に比べて胚発生率が高い結果となった。これらのことよりBCBによって推定されたG6PD活性は桑実胚期では雌胚で高く、また桑実胚期では胚の有する酵素活性差のため高酸素の気相条件によって胚がうける障害の程度が性間で異なり、それがその後の胚盤胞期胚への発生率にも影響することが示唆された。

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局所麻酔下での妊娠末期牛胎子へのカニュレーション手術による胎子血および羊・尿膜水採取（J. Reprod. Dev. 48: 455-460, 2002）

青木真理1)・木村康二1)・平子　誠1)・花房泰子2)・石崎　宏2)・假屋喜弘2)

1)独立行政法人農業技術研究機構・畜産草地研究所・家畜育種繁殖部
2)独立行政法人農業技術研究機構・畜産草地研究所・放牧管理部

　妊娠牛に生じる様々な生理現象や母子相互関係を明らかにするためには、母牛および胎子の内分泌変化を経時的に捉える必要がある。そこで、妊娠末期の胎子血管および羊�尿膜腔にカテーテルを装着し、分娩まで連続的に胎子血と羊�尿膜水の採取を行った。妊娠末期牛15頭に尾椎硬膜外または腰椎麻酔に局所浸潤麻酔を組み合わせて施し、簡易保定枠場上で立位のままカテーテル装着手術を行った。胎子血採取では、4種類のカテーテルを試したが、心臓血管カテーテルにスプリングチューブを被覆し、糸掛け具で胎子肢に固定したものが、7日以上連続して採取が可能であった。そのうち4頭が分娩まで採血可能であった。羊�尿膜水は、15頭中5頭にカテーテルを装着し、3頭で分娩まで完全に採取できた。供試牛は妊娠期間平均278日で分娩し、心臓カテーテルを用いた7頭のうち、軽い助産を要した2頭以外は自然分娩であった。胎子に血栓溶解剤を投与したもの（1頭）は死産したが、他6頭は母子とも正常であった。胎子血漿中コルチゾール濃度は手術直後には高く、術後24時間で降下し、手術のストレスは速やかに軽減され、以降の試料は分析に供することができると考えられた。その後は既存の報告と同様の経過をたどり分娩に至った。本研究において、本手術法および羊�尿膜水用カテーテルは比較的長期間にわたる採取に有効であり、また胎子血の採取には、心臓血管カテーテルにスプリングチューブを被覆したものが最適であることが示された。

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α-chlorohydrin暴露したラット精巣上体精子の運動性および先体反応の評価（J. Reprod. Dev. 48: 461-468, 2002）

加藤真之1)・牧野幸子1)・木村　均1)・太田隆雄1)・古橋忠和1)・長村洋一2)・平野和行3)

1)株式会社日本バイオリサーチセンター・試験管理部
2)藤田保健衛生大学衛生学部・臨床化学研究室
3)岐阜薬科大学・薬剤学教室

　0、0.01、0.1および1.0 mMのα-chlorohydrinを暴露したラット精巣上体精子を体外受精条件下で培養し、その先体反応と運動性の変化を調べた。精子の先体反応はFITCラベルしたConcanavalin A（FITC-ConA）lectin assayにCalcein acetoxy methyl ester（CAM）およびEthidium homodimer-1（EthD-1）とを組み合わせて、また運動性はComputer Assisted Sperm Analyzer（CASA）を用いてそれぞれ培養1、3および5時間に行った。α-chlorohydrin の0.01 mM群では、精子の運動性は培養5時間まで対照群とほぼ同様の変化を示した。0.1 mM群では、培養1時間には前進運動が認められたが、培養3および5時間には活力の弱い運動となった。1.0 mM群では、培養期間を通して低前進性および低活力の運動であった。先体反応を起こしたラット精子のFITC-ConAパターンは、その先体部位に緑色の蛍光発色が認められ、死亡精子の偽陽性反応と明瞭に区別することができた。対照群および0.01 mM群では、先体反応陽性精子の割合は培養時間に伴って増加した。一方0.1および1.0 mM群では、偽陽性反応精子の増加はみられなかったものの、先体反応陽性精子の割合は培養時間を通して低値を示した。以上の結果から、ラット精子はCAMおよびEthD-1を組み合わせたFITC-ConAにて先体反応の有無を明瞭に区別することが可能となった。α-chlorohydrinに暴露された精子では、活力の強い運動のみならず先体反応をも抑制されていたことが明らかとなり、この先体反応検出法は精子の受精能力を予測する上で有効な指標となり得る可能性が示唆された。

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シバヤギ胎盤から樹立したクローン化培養細胞株CPF-1におけるテロメア長短縮の解析（J. Reprod. Dev. 48: 469-476, 2002）

井上玄志1)・高梨藏人2)・野口多絵2)・林　真由2)・佐藤英明1)・舘　　鄰2)

1)東北大学大学院農学研究科
2)麻布大学獣医学部動物応用科学科

　我々は、ヤギにおいて培養体細胞の核移植によるクローン動物作出を最終的な目的とし、シバヤギ胎盤由来の初代培養細胞株から繊維芽細胞様細胞クローン化細胞株CPF-1と他のCPFサブクローンを樹立した。CPF-1細胞を増殖限界（51PDL; Population Doubling Level）まで培養したところ、細胞の加齢が進んだときに一般的に認められる変化である、細胞容積の増加、細胞分裂速度の低下が認められた。51PDLにおける単一細胞の平均細胞表面積は、継代早期（3PDL）に比較して約3倍に、有意に増加した（p＜0.01）。14PDLにおけるCPF-1細胞の染色体解析を行ったところ、約49.3%が正常な二倍体（2n = 60）の染色体構成を示し、全ての染色体はacrocentric型であった。異数体の見かけの発生率が高いことは、ヤギ細胞において良好な染色体標本を作成することが困難であることによる可能性もある。CPF-1細胞において、培養経過と共にテロメア長を解析したところ、継代早期と継代後期ではテロメア長に約2.5倍の差が生ずることが明らかになった。CPF-1におけるテロメア長短縮速度は約260 bp/PDLになり、他の細胞で報告されているテロメア長短縮速度（50-200 bases/PDL）より早い傾向が認められた。また、CPF-1細胞における分裂能は、平均テロメア長が約7.5 kb付近で消失したが、他の培養細胞株で報告されている値（5 kb）よりも有意に長かった。これらの現象の生物学的意味は現在の所不明である。

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甲状腺機能低下症rdwラットの排卵に及ぼす甲状腺ホルモン（T4）と性腺刺激ホルモン反復処理の影響（J. Reprod. Dev. 48: 477-483, 2002）

江　金益1)・飯島康仁1)・木村直子1)・梅津元昭1)・佐々田比呂志1)・佐藤英明1)

1)東北大学大学院農学研究科動物生殖科学分野

　rdwラットは甲状腺機能低下症ラットで排卵不全であるが、未成熟個体にT4を前処理することで過排卵を誘起でき、得られた卵子数が正常ラットよりも多いことを報告した。本研究では、rdwの排卵に及ぼすT4とeCG反復処理の影響を調べた。生後21日齢のrdwにT4を屠殺時まで連続投与し、eCGを28日齢時に注射し30日齢にhCGを処理後、その後1ヶ月間隔で同様の処理を計3回行った。各処理時にホルモン投与後雄と同居させ交配した�翌日屠殺し、正常、退行卵子数および受精率を調べた。卵巣重量と排卵数は正常とrdwラットの処理区間で有意差はなかったものの、T4処理のrdwでは1回目の排卵数が多かった。各処理区間のすべての処理回数において退行卵子数と受精率に有意差はなかった。以上の結果、rdwラットを反復排卵処理をすることにより正常卵子が得られることが示唆された。

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ニュージーランドから輸入されためん羊凍結精液による非繁殖季節に発情誘起された雌羊の受胎率（J. Reprod. Dev. 48: 485-488, 2002）

福井　豊1)・飯田憲司1)・岡田亜紀1)・亟々幸生1)・和知祥子1)・外川守彦1)

1)帯広畜産大学家畜育種増殖学講座

　本研究ではニュージーランドから輸入された凍結精液を用い、非繁殖季節に発情誘起した雌羊への人工授精による受胎率を検討した。3つの異なるめん羊牧場（T, S, M）において合計122頭のサフォーク種またはサフォーク交雑種を用いて、プロジェステロン含有膣内挿入具（CIDR-G）を12日間挿入し、CIDR除去1日前に500 IU妊馬血清性性腺刺激ホルモンを筋肉内投与した。T牧場においては75頭の雌羊を用い子宮内授精量（1頭当り0.2 mlまたは0.4 ml）および2頭の雄羊の個体差による影響を比較した。他の2牧場（S, M）では0.1から0.2 mlを牧場Tと同様に定時的に子宮内授精を行った。0.2 mlおよび0.4 mlを授精した雌羊の分娩率は68.4%および59.5%であり、雄羊の違いによる分娩率は61.3%および65.9%であった。各々の分娩率の間に有意差はみられなかった。SおよびM牧場における分娩率は54.2%および47.8%であった。全体を通して2頭の雄羊による分娩率（58.3%および59.5%）および産子率（2.03および1.61）に有意差はみられなかった。以上のことから非繁殖季節の雌羊にニュージーランドからの輸入凍結精液を授精して十分な受胎率が得られ、日本のめん羊牧場で新たな血統のサフォーク種雄羊および種雌羊が生産できる可能性が示唆された。

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ニワトリ（Gallus domesticus）の強制換羽における甲状腺刺激ホルモンmRNAと血中ホルモン濃度の変動（J. Reprod. Dev. 48: 489-496, 2002）

岩澤　淳1)・加藤幸雄2)・菱川朋子1)・土井　守1)・上吉道治1)・中村孝雄1)#

1)岐阜大学農学部・動物生産学講座
2)明治大学農学部・生命科学科
#現所属：岐阜県農業大学校

　絶食、絶水によって誘導した強制換羽期間中の、下垂体における甲状腺刺激ホルモンmRNA量と血清における各種ホルモン濃度をそれぞれ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応およびラジオイムノアッセイで測定した。血清中の黄体形成ホルモンおよびエストラジオールは実験開始の翌日（第1日）、プロジェステロンは第3日から低下し、産卵も4日目に停止した。実験区のチロキシンは第5日までに増加し、第17日においても増加したままであった。一方、トリヨードチロニンは実験期間中対照区より低い値を保っていた。実験区の甲状腺刺激ホルモンmRNA量は実験開始直後に急激に減少したが第3日には増加してピークとなり、その後は第17日まで緩やかに減少した。血清中プロラクチン濃度は第3日までに減少し、その後第17日まで低値を保った。コルチコステロンと成長ホルモンは実験開始後増加して第2日にピークとなり、以後減少して第17日には対照区と同レベルになった。これらの結果から（1）産卵に関係するホルモンの減少に続いて下垂体－甲状腺系の活性化が起こる（2）甲状腺刺激ホルモンはチロキシンの増加を引き起こすが、その後の高いチロキシンレベルの維持には必ずしも関与しない（3）強制換羽の内分泌機構にはプロラクチンも関与している可能性がある、という点が示唆される。

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分娩後早期授乳中に経膣的にプロジェステロンで前処置したシバヤギにおける低単位量hCGによる妊娠可能な発情の誘起効果（J. Reprod. Dev. 48: 497-504, 2002）

川手憲俊1)・山崎美恵1)・玉田尋通1)・稲葉俊夫2)・澤田　勉1)

1)大阪府立大学大学院・農学生命科学研究科・獣医繁殖学研究室
2)大阪府立大学大学院・農学生命科学研究科・細胞病態学研究室

　本研究は分娩後早期に経膣的にプロジェステロンで前処置したシバヤギにおける低単位量のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）の妊娠可能な発情を誘起する効果について検討するため実施した。分娩後約3週間を経過した授乳中のシバヤギ（13頭）に0.3 gのプロジェステロンを含む膣内挿入製剤（controlled internal drug releasing dispenser, CIDR）を7日間留置し、その抜去1日前に60 μgのクロプロステノールを投与した。グループ1のヤギ（6頭）はCIDR抜去時から発情が発現するまで12時間間隔で低単位量のhCG（1 IU/kg）を皮下投与した。グループ2のヤギ（7頭）はhCGのかわりに生理的食塩液を皮下投与した。グループ1の発情誘起率（83.3%）はグループ2（42.9%）に比較して、有意ではないが（P=0.14）、高い傾向を示した。グループ1におけるCIDR抜去から発情開始までの時間はグループ2に比較して有意に短かった（P＜0.05）。グループ1では血漿中エストラジオール-17β濃度の顕著なピークがCIDR抜去後30時間目でみられたが、一方、グループ2では２つの比較的小さな上昇が検出され、その最高値はCIDR抜去後48時間目であった。グループ1の妊娠率（83.3%）はグループ2（28.6%）に比較して有意に高い値を示した（P＜0.05）。これらの結果から、分娩後早期の授乳中のヤギにおけるCIDR留置後の低単位量のhCG投与は卵胞の成熟ならびに妊娠可能な発情の誘起を促進することが示唆された。

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胚由来細胞および卵丘細胞を用いたラットにおける核移植（J. Reprod. Dev. 48: 505-511, 2002）

江　金益1)・水野里志1)・水谷英二1)・三好和睦1)・木村直子1)・佐々田比呂志1)・佐藤英明1)

1)東北大学大学院農学研究科動物生殖科学分野

　着床前胚から細胞を樹立し、それをドナー細胞としたラットクローン動物を作出することを目的とした�胚から細胞の樹立を行った実験の結果、桑実期胚から細胞コロニーが得られなかったものの、胚盤胞および脱出胚盤胞期胚でそれぞれ89と40%の割合で細胞コロニーが得られた。得られた細胞コロニーは細胞間が明瞭で円形の形態を示した。この形態は、少なくとも継代が23回まで維持された。この細胞を0.5%FCS培地で48～72時間培養することでG0/G1期の割合が増加した。一方、卵丘細胞では93%がG0/G1期の細胞であった。これらの細胞をドナー細胞として核移植を行った結果、再構築胚の作出率および2細胞期までの発生率は胚由来細胞ではそれぞれ29%と3%であったのに対し、卵丘細胞では48%および35%であった。いずれの胚も2細胞期以降の発生は見られなかった。本研究の結果、胚盤胞期以降の胚を用いることで胚由来細胞を樹立することが可能であり、核移植のドナー細胞として利用できる可能性が示唆された。

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Y染色体の大部分を欠損している自然変異マウスの伸長精細胞アクロソームに出現する球状微小胞に関する研究（J. Reprod. Dev. 48: 513-521, 2002）

ジンダワン・シルンタヴィネッチ1)・山縣一夫1,2)・中西友子1,2)・馬場　忠1)

1)筑波大学応用生物化学系
2)大阪大学遺伝情報実験センター

　Y染色体が通常の約4分の1の長さしかない自然変異マウスYdelは、精子アクロソームの多くが扁平な異常構造をもっていることが知られている。Ydelマウスの精細胞でのアクロソーム形成をさらに詳細に調べるために、オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質（EGFP）がアクロソームに限定局在するトランスジェニックマウスとYdelマウスを交配させ、EGFPを指標としてそれらの精細胞と精子を形態学的に観察した。マウスアクロシン遺伝子プロモーター制御下で発現したEGFPはアクロソームに存在し、野生型とYdel変異マウスのアクロソーム形成を可視化することができた。Ydel変異マウス特異的に、ステージIX以降の伸長精細胞アクロソーム中にEGFPを含まない球状微小胞が出現していた。さらに精子形成が進むにつれて、球状微小胞のいくつかはアクロソームから離脱したが、大部分の微小胞はアクロソームに滞留したままであった。以上の結果から、この微小胞生成が変異マウスYdel精子アクロソームの異常構造と関連していることが示唆された。

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シバヤギの妊娠期に見られる血漿アミノ酸濃度の数理学的特徴づけ（J. Reprod. Dev. 48: 523-529, 2002）

須田義人1,2)・今川和彦1)・永岡謙太郎1)・酒井陽春2)・吉岡健一1)・松田二子1)・酒井仙吉1)・李　俊祐2)・澤崎　徹2)

1)東京大学大学院農学生命科学研究科・動物育種繁殖学研究室
2)東京大学農学部附属牧場

　効率的な動物生産を行うためには、妊娠診断技術の開発は必要不可欠である。妊娠期における母体では、妊娠認識に伴う生理活性物質の生合成や胎盤を介する血中アミノ酸の胎子側への供給などにより複雑かつ特異的な動態を示すことが推察できる。そこで生理栄養学的側面から妊娠診断技術を開発するために、東大農学部附属牧場で飼養されている閉鎖集団シバヤギ雌計10頭を供試し、妊娠群（5頭）と非妊娠群（5頭）から採血し血中アミノ酸濃度を解析した。次に、交配後補正平均50日から112日目の血漿中アミノ酸濃度について、線型判別分析を用いて妊娠と非妊娠動物に判別可能な特徴、及びその関数値（Z）の分布を検討した。その結果、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、グルタミン酸（Glu）そしてタウリン（Tau）の4種類のアミノ酸濃度を用いることで有意な線型判別モデル：Z = -3.80 - 0.036×Ile + 0.07×Leu + 0.12×Glu + 0.01×Tau（P＜0.05）を作成した。Zは妊娠群で正、非妊娠群で負に分布し、誤判別率は34.0%と中程度の正確度で有意に判別することができた。以上のことは、血漿中アミノ酸濃度に2群を区別するための相対的な特徴づけが可能であることを示唆しており、妊娠に伴って特異的なアミノ酸バランスを有する可能性があると考えられた。本研究は、従来の単体を用いて妊娠状態を明らかにするのではなく、複数種の情報を相対的かつ総合的に評価する重み付け変量を用いた線型モデルで統合することによって、正確性の高い妊娠判別を行うことが期待できる。

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クローニングしたウシ黄体形成ホルモンレセプターの全長cDNAのCOS-7細胞における発現（J. Reprod. Dev. 48: 531-538, 2002）

川手憲俊1)・玉田尋通1)・稲葉俊夫2)・澤田　勉1)

1)大阪府立大学大学院・農学生命科学研究科・獣医繁殖学研究室
2)大阪府立大学大学院・農学生命科学研究科・細胞病態学研究室

　クローニングしたウシの黄体形成ホルモン（LH）レセプターをコードする全長cDNAをCOS-7細胞で発現させ、そのタンパク質のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）との結合活性について検討した。ウシのLHレセプターcDNAの分子クローニングはウシの黄体から抽出した総RNAを用いてRT-PCR法により行った。重複部位を持つ3つのcDNAの部分的断片を増幅し、塩基配列の決定を行い、遺伝子工学の手法を用いて完全長のcDNAを構築し、それを哺乳動物細胞発現ベクターに組み込んだ。塩基配列の解析を行ったところ、ウシLHレセプターをコードする2,103塩基のオープンリーディングフレームが示され、26残基の推定上のシグナルペプチドと675残基の成熟レセプタータンパク質からなることが予想された。その成熟レセプタータンパク質のアミノ酸配列はブタ、ヒト、ラットおよびマウスと比較して、それぞれ94、88、86および85%の相同性を示した。ウシLHレセプターcDNAをCOS-7細胞にトランスフェクションし、その細胞を破砕せずにスキャッチャード分析を実施したところ、細胞上に高親和性かつ低受容量の[¹²⁵I]-hCGの結合部位の存在が示された。以上の成績から、今回クローニングしたウシLHレセプターcDNAから発現させたタンパク質はLH/hCGとの結合活性を持ち、細胞表面に位置することが示唆された。

［英文要旨＆PDF］

Volume 48, Number 5 (2002)